การสังเคราะห์ยีน: 5 วิธีและแอปพลิเคชันที่แตกต่างกัน

การผลิตยีนเคมีหรือการสังเคราะห์เป็นเสาหลักที่สำคัญในชีววิทยาโมเลกุลสมัยใหม่ช่วยในการผลิตยีนพื้นเมืองและยีนใหม่ (ที่ไม่เกิดขึ้นตามธรรมชาติ) ยิ่งไปกว่านั้นกระบวนการนี้เป็นพื้นฐานสำหรับการผลิตจีโนมทั้งหมด (ชุดคำแนะนำทางพันธุกรรมที่สมบูรณ์ที่มีอยู่ในเซลล์ที่มีชีวิต)

ความก้าวหน้าใน การสังเคราะห์ยีน หมายถึงวิธีการผลิตยีนที่หลากหลายมีให้สำหรับผู้มีส่วนได้เสีย อย่างไรก็ตามแต่ละวิธีมีแอปพลิเคชันเฉพาะของมันการสังเคราะห์ยีนที่เฉพาะเจาะจงและเทคนิคหนึ่งไม่สามารถแทนที่ได้ ดังนั้นด้านล่างนี้เป็นภาพรวมของเทคนิคการสังเคราะห์ยีนทั่วไปและลักษณะของพวกเขาเพื่อเป็นแนวทางในการเลือกวิธีการของคุณสำหรับโครงการที่แตกต่างกัน

โปรโตคอลการสังเคราะห์ยีน?

การผลิตยีนสังเคราะห์เป็นกระบวนการแบบขั้นตอนที่อำนวยความสะดวกในการผลิตยีนและผลิตภัณฑ์ยีนอื่น ๆ โดยไม่ต้องพึ่งพาเทมเพลต DNA ดังนั้นจึงอำนวยความสะดวกในการผลิตยีนที่หลากหลายรวมถึงยีนที่กำหนดเองที่มีลำดับการแก้ไขหรือคู่ฐาน

ตามที่ระบุไว้ข้างต้นความก้าวหน้าในเทคโนโลยีชีวภาพหมายความว่ามีเทคนิคการผลิตยีนสังเคราะห์หลายอย่าง อย่างไรก็ตามเทคนิคทั้งหมดยืมจากกระบวนการผลิตยีนพื้นเมืองของสิ่งมีชีวิตเป็นพื้นฐานสำหรับการผลิตยีนเคมีโดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยที่นี่และที่นั่น

ดังนั้นการทำความเข้าใจกระบวนการสังเคราะห์ยีนพื้นฐานช่วยชื่นชมความแตกต่างระหว่างเทคนิคการสังเคราะห์ยีน ด้านล่างนี้เป็นภาพรวมของขั้นตอนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ยีน

การสังเคราะห์ Oligonucleotide

Oligonucleotides เป็นกรดนิวคลีอิกสั้น (DNA หรือ RNA) และฟังก์ชั่นเป็นหน่วยการสร้างสำหรับการผลิตผลิตภัณฑ์ยีนใด ๆ รวมถึงเปปไทด์และการสังเคราะห์โปรตีน วิธีการสังเคราะห์ยีนที่แตกต่างกันใช้รีเอเจนต์และเทคนิคที่แตกต่างกันในการเริ่มต้นการสังเคราะห์ oligonucleotide อย่างไรก็ตามกระบวนการเคลื่อนที่ในทิศทาง 3 'ถึง 5' ในทุกวิธี

การหลอม Oligonucleotide

การหลอมสร้างโมเลกุลที่ให้ความร้อนเช่น oligonucleotides ก่อนที่จะเย็นลงเรื่อย ๆ เพื่ออำนวยความสะดวกในการผสมพันธุ์หรือการก่อตัวของพันธะเคมีระหว่างสองโมเลกุล วิธีการสังเคราะห์ยีนที่แตกต่างกันใช้เทคนิคการทำลายล้างที่ไม่ซ้ำกันเพื่อสร้างลำดับยีนที่สมบูรณ์

การโคลนนิ่งลำดับยีน

การโคลนทำให้เกิดสำเนาของลำดับยีนที่ขึ้นรูปใหม่โดยใช้เวกเตอร์การโคลนนิ่ง

การคัดกรองโคลน

การสังเคราะห์ยีนไม่ใช่กระบวนการที่สมบูรณ์แบบ ดังนั้นการคัดกรองโคลนจึงจำเป็นต้องระบุยีนเป้าหมายภายในโคลนนิ่ง เครื่องมือยอดนิยมรวมถึงชุด ELISA และโครมาโตกราฟี

การวิเคราะห์ลำดับและการแก้ไขข้อผิดพลาด

นอกเหนือจากการระบุยีนเป้าหมายแล้วยังจำเป็นต้องมีการวิเคราะห์คู่ฐานในลำดับอย่างละเอียด ยิ่งไปกว่านั้นมาตรการแก้ไขเพื่อแก้ไขข้อผิดพลาดในการจำลองเช่นการลบฐานและการทดแทนทำให้มั่นใจได้ว่าตำแหน่งพลาสมิดที่ต้องการ

วิธีการและแอปพลิเคชัน

ด้านล่างนี้เป็นภาพรวมของวิธีการสังเคราะห์ยีนที่ได้รับความนิยมมากที่สุดและแอปพลิเคชัน

1. การสังเคราะห์เฟสของแข็ง

การสังเคราะห์แบบโซลิดเฟสเป็นวิธีการสังเคราะห์ยีนคลาสสิกและสร้างขึ้นโดยใช้นิวคลีโอไซด์ที่ดัดแปลงทางเคมีรวมถึงกรดนิวคลีอิกล็อค (LNAs) เพื่อสังเคราะห์โอลิโกนิวคลีโอไทด์เป้าหมาย คอลัมน์รีเอเจนต์ที่มีกรด deBlocking ถือนิวคลีโอไซด์ที่ค่อยๆก่อตัวเป็นห่วงโซ่ oligonucleotide ด้วยการ deprotection ของนิวคลีโอไซด์ที่ตามมา

กระบวนการประกอบเอนไซม์ก่อให้เกิด de-blocking (deprotection) ของนิวคลีโอไซด์ตามด้วยการมีเพศสัมพันธ์การกำหนดและการเกิดออกซิเดชันเพื่อสร้างลำดับยีนจาก oligonucleotides ที่สร้างขึ้นใหม่ การสังเคราะห์แบบโซลิดเฟสเป็นกระบวนการที่อัตโนมัติและนักวิจัยรวบรวมยีนในตอนท้าย ข้อดีของมันรวมถึงความแม่นยำของลำดับยีนที่สูงอย่างน่าทึ่ง  

อย่างไรก็ตามกระบวนการ deprotection เพิ่มโอกาสในการเกิดปฏิกิริยาข้างเคียงและความเสี่ยงเพิ่มขึ้นตามความยาวที่เพิ่มขึ้น ดังนั้นการสังเคราะห์เฟสของแข็งจะสร้างยีนที่มีความยาว 15-25 ฐาน (200 นิวคลีโอไทด์ตกค้างสูงสุด) ยีนดังกล่าวมีการประยุกต์ใช้ในชีววิทยาโมเลกุลและการแพทย์รวมถึง antisense ในการสังเคราะห์โปรตีนหรือเป็นโพรบสำหรับการตรวจจับเรื่องทางพันธุกรรมเสริม

2. การสังเคราะห์ดีเอ็นเอที่ใช้ชิป

การสังเคราะห์ DNA ที่ใช้ชิปเป็นกระบวนการสังเคราะห์ยีนรุ่นต่อไป ซึ่งแตกต่างจากการสังเคราะห์เฟสของแข็งซึ่งเป็นกระบวนการทางเคมีการสังเคราะห์ที่ใช้ชิปเป็นกระบวนการทางเคมีไฟฟ้า

วิธีการใช้ชิปเซมิคอนดักเตอร์ microarray ที่ติดตั้งการควบคุมอุณหภูมิเพื่อสร้าง oligonucleotides หลายตัวภายในการตั้งค่าเดียว การสังเคราะห์ที่ใช้ชิปช่วยเติมเต็มกระบวนการทางเคมีของวัฏจักรฟอสฟอราไมด์แบบดั้งเดิมโดยการสร้างกระเป๋าของโซนที่ควบคุมอุณหภูมิที่เรียกว่าหลุม/ เกาะเสมือนจริงช่วยอำนวยความสะดวกในการเลือก

ยิ่งไปกว่านั้นมันช่วยให้การตรวจจับข้อผิดพลาดและการแก้ไขในระหว่างกระบวนการประกอบ oligonucleotide และไม่จำเป็นต้องมีการวิเคราะห์ลำดับแยกต่างหากและขั้นตอนการแก้ไขข้อผิดพลาด ข้อดีของการสังเคราะห์ที่ใช้ชิปรวมถึงปริมาณงานที่สูงและความสามารถในการสร้างชิ้นส่วนยีนที่มีคู่ฐานยาวขึ้น เทคนิคนี้สร้างลำดับยีนสำหรับแอปพลิเคชันที่ต้องการปริมาณ DNA เป้าหมายสูงและความแม่นยำต่ำ

3. การสังเคราะห์เอนไซม์ที่ใช้ PCR

PCR (ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส) การสังเคราะห์ยีนเป็นกระบวนการคลาสสิกที่สร้างชิ้นส่วนยีนนับล้านในสองขั้นตอนที่ใช้ไพรเมอร์ ขั้นตอนแรกคือการรวบรวมนิวคลีโอไทด์ที่ทับซ้อนกันผ่านปฏิกิริยาลูกโซ่ที่กำหนดตนเองเพื่อสร้าง oligonucleotide 60bp ซึ่งครอบคลุมทั้งลำดับ

ประการที่สองปฏิกิริยา PCR ที่ตามมาจะสร้างชิ้นส่วน DNA ยาว 400-500bp ไพรเมอร์เพิ่มเติมขยายส่วน DNA เป้าหมาย วิธีนี้เหมาะสำหรับการใช้งานที่ต้องการชิ้นส่วนยีนที่มีความแม่นยำสูง

4. การสังเคราะห์ยีนจากสระโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ได้จากอาเรย์

การสังเคราะห์ยีนที่ได้มาจากอาเรย์เป็นกระบวนการผลิตยีนที่มีราคาไม่แพงมากที่สุดเนื่องจากการใช้สารรีเอเจนต์ต่ำ ประการที่สองวิธีนี้รองรับความจุมัลติเพล็กซ์สร้างลำดับ oligonucleotide หลายพันถึงหมื่น

อย่างไรก็ตามในขณะที่ลำดับ oligonucleotide ที่หลากหลายนั้นเป็นข้อดีการประกอบ oligonucleotides เป็นชิ้นส่วนยีนที่ทำงานได้นั้นเป็นสิ่งที่ท้าทายเนื่องจากลำดับความคล้ายคลึงกัน ดังนั้นวิธีการนี้เหมาะสำหรับกระบวนการสังเคราะห์ยีนที่กำหนดเองซึ่งต้องใช้ชิ้นส่วนของยีนในปริมาณที่ต่ำกว่ามาก

5. การสังเคราะห์ยีนของเหลวเฟส

การสังเคราะห์ยีนของเหลวเฟสเป็นเทคนิคคลาสสิกที่คล้ายคลึงกันในหลาย ๆ องค์ประกอบในการสังเคราะห์เฟสโซลิดเฟส อย่างไรก็ตามแตกต่างจากการสังเคราะห์ของโซลิดเฟสการสร้าง oligonucleotide เกิดขึ้นในการแก้ปัญหามากกว่าการสนับสนุนคอลัมน์ นอกจากนี้การสังเคราะห์ยีนของเหลวเฟสยังมีความเสี่ยงต่อการเกิดปฏิกิริยาโซ่ด้านล่างและสามารถสร้างชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีความยาวที่มีข้อผิดพลาดน้อยที่สุดแม้ว่าจะช้าลง

บทสรุป

เทคนิคการสังเคราะห์ยีนมีการพัฒนาอย่างต่อเนื่องเพื่อตอบสนองความต้องการที่เพิ่มขึ้นสำหรับยีนคุณภาพสูงประสิทธิภาพต้นทุนและความสามารถในการปรับขนาด วิธีการที่เน้นด้านบนเป็นวิธีการผลิตยีนหลักและคุณสามารถปรึกษาผู้ให้บริการของคุณเกี่ยวกับวิธีการที่เหมาะสำหรับโครงการและงบประมาณของคุณ

‍